...
Головна » Статті » Оптическая системы в биологических исследованиях

Оптическая системы в биологических исследованиях

Строение микроскопа

Микроско́п (греч. μικρός — маленький и σκοπέω — смотрю) — прибор, предназначенный для получения увеличенных изображений, а также измерения объектов или деталей структуры, невидимых или плохо видимых невооружённым глазом.

Совокупность технологий и методов практического использования микроскопов называют микроскопией.

Конструктивные части микроскопа:

Механическая: основания, тубус, тубус содержатель, предметный столик, револьвер, макровинт, микровинт, винт конденсатора.
Оптическая система: окуляр и объктив(малого, большого, иммерсионного увеличения)
Осветительная система: зеркало, окнденсор, диафрагма.
Правила работы с микроскопом:
1. Поставить микроскоп прямо перед собой, ручкой штатива к себе;
2. Установить объектив малого увеличения против отверстия предметного столика на расстоянии 1-2 см от него;
3. Осветить поле зрения зеркалом;
4. Вращая винт конденсора, добиться яркого изображения;
5. Положить препарат на предметный столик, покровным стеклом вверх;
6. Смотря в окуляр, осторожно вращать макровинт на себя, пока не пока не появиться изображение;
7. Чтобы перейти на большое увеличение, надо глядя сбоку, вращением револьвера установить объектив х40 над препаратом до щелчка. Затем вращением микровинта на себя или от себя добиться четкого изображения;
8. По окончании работы с микроскопом перевести револьвер на малое увеличение;
9. Смотреть в микроскоп левым глазом, не закрывая правый.

Увеличения светового микроскопа= увеличение окуляра х увеличение объектива

Разрешающая способность микроскопа - способность микроскопа давать раздельное изображения двух точек, лежащих исключительно близко друг от друга. Ограничена длинной волны луча света. Для светового микроскопа разрешающая способность равная 200 нм.

Методы цитологических исследований


1. Метод световой микроскопии – позволяет изучить форму , размер, структуру клеток, клеточных органелл на живых и фиксированных препаратах, окрашенных и не окрашенных.
2. Метод электронной микроскопии – позволяет изучать ультраструктуру клетки и клеточных органелл. Использует поток электронов в вакууме вместо луча свет и электромагниты вместо линз. Разрешающая способность 0,1 нм.
Виды электронной микроскопии:
-трансмиссионная – даёт плоскостное чёрно-белое изображения объекта
-сканирующая – даёт объемное 3D-изображение.
3. Метод дифференциального центрифугирования(фракционированье) – позволяет получить отдельные фракции органелл под действием центробежной силы в центрифуге.
4. Метод гистологии и гистохимии – изучает локализацию различных химических веществ в тканях на фиксированных и окрашенных препаратах.
5. Метод авторадиографии(изотопный метод) –использует маркирования нужных молекул изотопным индикатором, позволяет выявить распределите веществ в объекте, его состав и интенсивность метаболизма(молекулярные процессы) .
6. Метод культуры тканей – позволяет изучать живые объекты их деления и рост вне организма. Используют в искусственных питательных средах в пробирках.
7. Метод микрохирургии – позволяет удалять и имплантировать отдельные органеллы, пересаживать их из клетки в клетку и разделять их в ткани.

Гистологическая обработка ткани

Гистологической обработке предшествует биопсия – прижизненное иссечение части тканей организма для микроскопического исследования.
1. Фиксация – это воздействие химическими (формальдегид, этанол и другие) или физическими агентами (замораживание) на ткани в течении 15 минут для коагуляции белков и прекращения процессов жизнедеятельности.
2. Обезвоживание – это удаление воды в спиртах восходящей концентрации ( от 50 до 100 градусов)
3. Пропитывание растворителем(ксилолом, хлороформом или эфиром) – осуществляется для облегчения проникновения в ткани заливочной среды.
4. Пропитывания жидким парафином – в специальные формочки на 2-3 для заливается смесью парафина и ксилола для насыщения тканей
5. Изготовления блоков с тканями – заключается в вырезании парафинового блока с тканью и наклейке его на деревянный брусок густым парафином.
6. Получение срезов с помощью микротома – требует применения специальных прибора – микротома. Блок неподвижно фиксируют в объектодержателе микротома , после чего делают срезы необходимой толщины(5-15 мкм). Затем их снимают с ножа.
7. Депарафинирование – срезы опускают сначала в теплый ксилол вместе с предметным стеклом для растворения парафина, затем в 96% этанол и подсуживают.
8. Окраска биологических структур с помощью красителей:
Основные красители связываются со структурными клетками, имеющими кислую рН (ядрышко, хроматин, цитоплазма). К основным красителям относятся: гематоксилин, метиленовый синий, тионин, азур. Структурные клетки, окрашиваемые основными красителями называют базофильными.
Кислые красители – пикриновая кислота, фуксин, эозин. Связываются со структурными клетками, имеющие щелочную среду рН (цитоплазма, лейкоциты, коллагеновые волокна ) и придают им цвет красителя. Их называют оксифильными.
Нейтральные красители представляют собой смеси основных и кислых компонентов, как судак III. Ими окрашиваются гранулы нейтрофильныхх лейкоцитов и цитоплазма. Называют нейтрофильными.
9. Заключение в бальзам – помещения срезов в канадский бальзам после обезвоживания в спиртах восходящих концентрациях. Иногда препараты заключают в водорастворимые среды(глицерин, желатин) либо в их смеси.

Оптична системи в біологічних дослідженнях

будова мікроскопа

Мікроскоп (грец. μικρός - маленький і σκοπέω - дивлюся ) - прилад , призначений для отримання збільшених зображень , а також вимірювання об'єктів або деталей структури , невидимих чи погано видимих неозброєним оком.

Сукупність технологій і методів практичного використання мікроскопів називають мікроскопією .

Конструктивні частини мікроскопа :

Механічна : підстави , тубус , тубус утримувач , предметний столик , револьвер , макрогвинт , мікрогвинт , гвинт конденсатора.
Оптична система: окуляр і об'єктив ( малого , великого , иммерсионного збільшення)
Освітлювальна система: дзеркало , конденсор , діафрагма.
Правила роботи з мікроскопом :
1 . Поставити мікроскоп прямо перед собою , ручкою штатива до себе ;
2 . Встановити об'єктив малого збільшення проти отвора предметного столика на відстані 1-2 см від нього ;
3 . Висвітлити поле зору дзеркалом ;
4 . Обертаючи гвинт конденсора , домогтися яскравого зображення;
5 . Покласти препарат на предметний столик , покривним склом вгору ;
6 . Дивлячись в окуляр , обережно обертати макровінт на себе , поки не поки не з'явитися зображення ;
7 . Щоб перейти на велике збільшення , треба дивлячись збоку , обертанням револьвера встановити об'єктив х40 над препаратом до клацання. Потім обертанням мікрогвинта на себе або від себе добитися чіткого зображення;
8 . Після закінчення роботи з мікроскопом перевести револьвер на мале збільшення ;
9 . Дивитися в мікроскоп лівим оком , не закриваючи правий .

Збільшення світлового мікроскопа = збільшення окуляра х збільшення об'єктива

Роздільна здатність мікроскопа - здатність мікроскопа давати роздільне зображення двох точок, що лежать виключно близько один від одного. Обмежена довгої хвилі променя світла . Для світлового мікроскопа роздільна здатність дорівнює 200 нм.

Методи цитологічних досліджень


1 . Метод світлової мікроскопії - дозволяє вивчити форму , розмір , структуру клітин , клітинних органел на живих і фіксованих препаратах , забарвлених і не пофарбованих .
2 . Метод електронної мікроскопії - дозволяє вивчати ультраструктуру клітини і клітинних органел. Використовує потік електронів у вакуумі замість променя світло і електромагніти замість лінз. Роздільна здатність 0,1 нм.
Види електронної мікроскопії :
- трансмісійна - дає площинне чорно- біле зображення об'єкта
- скануюча - дає об'ємне 3D-зображення .
3 . Метод диференціального центрифугування ( фракціонування ) - дозволяє отримати окремі фракції органел під дією відцентрової сили в центрифузі .
4 . Метод гістології та гистохимии - вивчає локалізацію різних хімічних речовин в тканинах на фіксованих і пофарбованих препаратах.
5 . Метод авторадіографії ( ізотопний метод) - використовує маркування потрібних молекул ізотопним індикатором , дозволяє виявити розподіліть речовин в об'єкті , його склад і інтенсивність метаболізму ( молекулярні процеси).
6 . Метод культури тканин - дозволяє вивчати живі об'єкти їх ділення і зростання поза організмом. Використовують в штучних поживних середовищах в пробірках .
7 . Метод мікрохірургії - дозволяє видаляти і імплантувати окремі органели , пересаджувати їх з клітки в клітку і розділяти їх в тканини.

Гістологічна обробка тканини

Гістологічної обробці передує біопсія - прижиттєве висічення частини тканин організму для мікроскопічного дослідження.
1 . Фіксація - це вплив хімічними ( формальдегід , етанол та інші) або фізичними агентами (заморожування ) на тканини в перебігу 15 хвилин для коагуляції білків і припинення процесів життєдіяльності.
2 . Зневоднення - це видалення води в спиртах висхідної концентрації (від 50 до 100 градусів)
3 . Просочування розчинником ( ксилолом , хлороформом або ефіром ) - здійснюється для полегшення проникнення в тканини заливальної середовища .
4 . Просочування рідким парафіном - у спеціальні формочки на 2-3 для заливається сумішшю парафіну і ксилолу для насичення тканин
5 . Виготовлення блоків з тканинами - полягає в вирізання парафинового блоку з тканиною і наклейці його на дерев'яний брусок густим парафіном.
6 . Отримання зрізів за допомогою мікротому - вимагає застосування спеціальних приладу - мікротому . Блок нерухомо фіксують у об'ектодержателе мікротому , після чого роблять зрізи необхідної товщини (5-15 мкм). Потім їх знімають з ножа.
7 . Депарафінірованіе - зрізи опускають спочатку в теплий ксилол разом з предметним склом для розчинення парафіну , потім в 96% етанол і підсуджують .
8 . Забарвлення біологічних структур за допомогою барвників :
Основні барвники зв'язуються зі структурними клітинами, що мають кислу рН ( ядерце , хроматин , цитоплазма ) . До основних фарбників відносяться : гематоксилін , метиленовий синій , тіонін , АЗУР . Структурні клітини , забарвлювані основними барвниками називають базофільними .
Кислі барвники - пікринова кислота , фуксин , еозин . Зв'язуються зі структурними клітинами , що мають лужне середовище рН ( цитоплазма , лейкоцити , колагенові волокна) і надають їм колір барвника. Їх називають Оксифільні .
Нейтральні барвники являють собою суміші основних і кислих компонентів , як судак III . Ними фарбуються гранули нейтрофільнихх лейкоцитів і цитоплазма . Називають нейтрофільними .
9 . Висновок в бальзам - приміщення зрізів в канадський бальзам після зневоднення в спиртах висхідних концентраціях. Іноді препарати містять в водорозчинні середовища ( гліцерин , желатин ) або в їх суміші.